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德州之星pokerstars塗裝詳解:電泳塗裝技術原理

发布时间:2018-12-09 10:08:55  作者:德州之星pokerstars  來源:石家莊德州之星pokerstars  浏覽量:

1、電泳、遷移率
 
電泳(Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場中向帶相反電荷的電極方向移動的
 
現象。在生物科學中,電泳技術廣泛應用于蛋白質、核酸和氨基酸等物質的分離和鑒定。
 
因爲帶電粒子的移動速度和電場強度有密切關系,所以爲了表示不同物質有不同泳動速
 
度的特性,通常使用“遷移率”(Mobility)的概念。帶電粒子在電泳時的遷移率,就是指在單位電場強度下粒子的移動速度( VX )。
 
2、影響遷移率的因素
 
在電泳过程中,带電粒子的移动速度 v 除与粒子所带電荷量 Q 及電场强度 X 有关外,还与粒子半径 r 及介质的粘度η有关:
 
v QX
 
6πrη
 
式中 6 π是适用于球形带電粒子的经验数值,对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不
 
同。可見,帶電粒子的移動速度和粒子的本身的性質有密切關系,粒子表面所帶電荷量和物
 
質的組成結構有密切關系。此外,粒子的大小(分子量)及粒子的形狀等也有重要的影響。
 
所以,在一定電場強度下,不同種類的帶電物質在電泳時的移動速度就不能完全一致,這種
 
移動速度的差異就是電泳技術的基本依據。
 
(1)樣品
 
帶電化合物的性質在幾個方面影響著它們的遷移率。
 
(1)電荷:迁移率随净電荷的增加而增加。電荷的大小一般由 pH 决定。
 
(2)分子大小:對于較大的分子,由于周圍介質所引起的摩擦力和靜電力的增加,遷
 
移率下降。
 
(3)形狀:同樣大小的,但是具有不同形狀的分子,如纖維狀的蛋白質和球狀蛋白質,
 
因摩擦力作用不同,而表現有不同的遷移特征。
 
(2)電場
 
歐姆定律表示了電流 A(安培)、電壓 V(伏特)和電阻 ?(歐姆)之間的關系:A=V
 
/?。因此,離子在電場中的分離受到這三個因素的影響。

 
(1)電流:由于在二個電極之間溶液中的電流完全由緩沖液和樣品的離子來傳導,因
 
此,遷移率與電流成正比。離子遷移的距離與通電時間成正比。因此,爲了得到最好的重複
 
性,在電泳時電流必須保持恒定。當然必須使用直流電。
 
(2)電壓:電壓控制著電流,因此,遷移率與加在支臣堥質兩端的電位差成正比。這
 
是電壓梯度,一般用伏特/厘米(V/cm)來表示(即,所加的電壓除以支臣堥質的長度)。
 
可以使用低電压(100-500 伏),或者高電压(500-10,000 伏),電压梯度分别可达 20 和
 
200 伏/厘米。高電壓主要是用于分離小分子的化合物。
 
(3)電阻:遷移率與電阻成反比,電阻由支臣堥質的類型和大小,以及緩沖液的離子
 
強度所決定。電阻隨支臣堥質的長度而增加,隨支臣堥質的寬度和緩沖液離子強度的增加而
 
降低。
 
在電泳時以A2?瓦特的比率産生熱,並且電阻隨溫度升高而下降。因此,如果電壓保持
 
不變,那麽這種溫度的升高將會引起電流的升高,並且促使了支臣堥質上溶劑的蒸發。爲了
 
盡可能得到可重複的結果,使用經過穩定的電源裝置,盡管由于溫度的波動,不可避免地會
 
引起電阻的改變,但是這種電源能自動地保持電壓或者電流的恒定。用一個密閉的蓋子罩住
 
電泳槽以減少蒸發。在電泳槽中附設一個冷卻系統,在高壓工作時起到外加冷卻的作用。
 
(3)緩沖液
 
緩沖液決定著並穩定著支臣堥質的 pH,並且通過很多途徑也影響著化合物的遷移率。
 
(1)成分:通常所用的緩沖液是甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、巴比妥鹽和磷酸鹽、Tris、
 
EDTA 和吡啶。硼酸緩沖液经常用于碳水化合物的分离,因为它们能和碳水化合物产生带電
 
的複合物。
 
因爲緩沖液是樣品的溶劑,因此,不可避免的會有一定強度的樣品擴散。特別值得注意
 
的是像氨基酸和糖一類的小分子。讓樣品走成很窄的帶,避免過量的加樣;在一個盡可能短
 
的時間內使用高電壓;以及在分離完成後迅速地取出並幹燥等都能縮小擴散的適度。
 
(2)濃度:由于緩沖液離子強度的增加,緩沖液所載的分電流也隨之增加,樣品所載
 
的電流則降低,因此而減緩了樣品的遷移率。增加緩沖液的離子強度也增加了總電流,因而
 
增加了熱的産生。
 
在低離子強度時,緩沖液所載的電流下降,樣品所載的電流增加,因此加速了樣品的遷
 
移。低離子強度的緩沖液降低了總電流,結果減少了熱的産生,但是擴散較嚴重,使分辨力
 
明顯的降低。
 
所以,选择离子强度时必须两者兼顾,一般离子强度的选择范围在 0.02~0.2 之间。离子

強度= 12 ∑ CZ 2,C是離子的克分子濃度,Z是它所帶的電荷。
 
 
(3)pH:像无机盐那样的完全离子化的化合物,pH 的作用不大。但是对于有机化合
 
物,pH 决定了它的電离程度。有机酸的電离随 pH 的增加而增加,有机碱则相反;因此,
 
它们的迁移程度由 pH 决定。对于像氨基酸一类既有碱性也有酸性的化合物(两性電解质),
 
兩種作用都有。
 
因此,两性電介质迁移的方向以及迁移的程度由 pH 决定,根据分离的需要可以使用 pH
 
从 1-11 范围内的緩沖液。
 
在兩個蓄水槽中的緩沖液一般是相同的,用來飽和支臣堥質,但是,在凝膠電泳中,緩
 
沖液是支臣堥質的一部分,因此,在凝膠中經常使用一種與緩沖液槽中不相同的緩沖液。這
 
樣能使電泳得到很好的分辨率。
 
(4)支臣堥質
 
雖然使用了比較惰性的材料作爲支臣堥質,但是介質的精確結構對一種化合物的遷移率
 
有很多影響,而對介質的選擇取決于所用的樣品類型。
 
(1)吸附:
 
正如吸附層析一樣,這是支臣堥質對樣品分子的滯留作用。它導致了樣品的拖尾,使樣
 
品的移動像一個彗星,不能形成一條很清晰的帶,因而降低了分離的分辨率。吸附也降低了
 
總的遷移率。紙的吸附最大,但使用醋酸纖維素實際上可以消除這種作用。
 
(2)電滲(電內滲):
 
這種現象是由緩沖液的水分子和支臣堥質的表面之間所産生的一種相關電荷引起的。由
 
于支臣堥質中基團的電離作用以及對緩沖液離子的表面吸附作用,通常由水分子産生水合氫
 
離子(H3O)。由于這些離子是帶正電荷的。因此它們帶著溶解的中性物質移向陰極,加速
 
了陽離子的前進、而阻滯了陰離子的移動。這種作用一般可以忽略不計,但是,如果在測定
 
化合物的等電點時,這種作用必須被考慮,一般通過對一種中性的分子(如脲或葡萄糖)進
 
行電泳,測定它們遷移的程度來決定。醋酸纖維素或聚丙烯酰胺凝膠的電滲作用沒有紙或澱
 
粉膠那麽明顯。
 
(3)分子篩:
 
這是凝膠電泳的一個特性。在這種電泳中,半剛性支臣堥質(凝膠)的分子篩特性有助
 
于蛋白質一類不但在電泳移動率方面有所區別,而且在大小、形狀上也有所不同的大的離子
 
化合物的分離。凝膠是由分布于整個凝膠的自由纏繞的分子鏈組成,這些分子鏈使凝膠成爲

 
一種篩樣的結構。凝膠的孔徑可以在一定的範圍內有所不同,而使之適合于特殊的分析。瓊
 
脂、澱粉和聚丙烯酰胺凝膠的分子篩原理是,大分子的移動隨凝膠中交聯度的增加,孔徑的
 
减少,而阻力逐渐增加。如果使用 Sephadex 型的凝胶,情况正相反,因为它的特性对于小
 
分子遷移的阻礙作用要比大分子來得大。
 
(二)紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳
 
紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳就是利用濾紙或醋酸纖維素薄膜作爲支持物的電泳技
 
術。
 
紙上電泳是在 1940 年前后和紙上层析一道发展起来的分离分析技术,由于它们都具有
 
简便、迅速而且分离效果好等特点,到 50 年代已成为应用非常普遍的实验室方法,并在这
 
基礎上發展了一批類似的使用固相支持物薄膜的分離方法,醋酸纖維素薄膜電泳就是其中發
 
展较早的一种常用技術。
 
紙上電泳所需的設備很簡單:一個供給穩壓直流電電源和一個簡單的電泳槽。電泳槽通
 
常由玻璃或有機玻璃等塑料制成,目前常用的是平臥式的電泳槽。它內部有兩個分隔的緩沖
 
液槽,分別裝有鉑絲或其它材料的電極。在這兩緩沖液槽中間的上部有支架,供放置(平放)
 
濾紙用,濾紙兩端分別浸入兩個槽內的緩沖液中。在電泳上部還有蓋,以減少液體蒸發,有
 
時還裝有適當的冷卻裝置,以減輕電泳對發熱所造成的影響。平臥式電泳槽不僅適用于紙上
 
電泳,而且也適用于醋酸纖維素薄膜及其它類型薄膜電泳,此外,瓊脂凝膠、澱粉凝膠等平
 
板凝膠電泳也可以適用。
 
 \
 
 

緩醋
沖酸
  液纖  
       
         
         
 
图 1-2 用于濾紙或醋酸纤維素薄膜電泳用的電泳槽
 
 
 
适用于紙上電泳及醋酸纤維素薄膜電泳的緩沖液种类很多,对于蛋白质電泳多采用巴比
 
妥緩沖液。例如血清蛋白质的電泳常用 pH 8.6 的巴比妥緩沖液,浓度可在 0.05~0.1M 之间
 
选用。浓度较高的緩沖能力较强,可以保证電泳过程中濾紙上緩沖液不因盐类的電解而姓过

 
份明显的影响,但因离子强度较高,電泳的速度较慢,需要的電泳时间较长。反之,浓度较
 
低的緩沖能力较弱,在電泳过程中因 pH 值的变化较大可能影响電泳的效果,但它的离子强
 
度较低,電泳速度较快,需要電泳时间较短,适于进行快速鉴定。
 
紙上電泳及醋酸纤維素薄膜電泳的基本过程包括如下几个步骤:
 
1、准备-将适当的緩沖液倾入電泳槽中,将濾紙或醋酸纤維素薄膜(经緩沖液湿润的)
 
用铅笔在离一端一定距离处作好起点线记号后放在支架上,使濾紙两端或醋酸纤維素薄膜两
 
端相连的濾紙桥浸入緩沖液中。将两電極接连電源(如果是用 pH 8.6 緩沖液分离血清蛋白
 
质,起点线侧应接上负極)。
 
2、點樣-用點樣器或毛細管將樣品點在起點線上,通常每個樣品的加樣寬度約 1~2
 
厘米,加样量约 10 微升(根据样品浓度不同而异,可通过试验确定)。
 
3、通電-点样后加蓋,打开電源的开关,调节電压(或電流)达到要求的数值。通常
 
電压可在 1~10 伏/厘米范围内选择,電流可在 0.2~2 毫安/厘米(宽)的范围内选择。对
 
于紙上電泳应选择较低的電压(或電流),而醋酸纤維素薄膜電泳则可选择较高的電压或電
 
流,因此紙上電泳的通電时间相应要长一些,而醋酸纤維素薄膜電泳则相应要短一些。加以
 
后者的電渗和吸附能力小,分离效果好,可以用较短的電泳距离(即较短的電泳薄膜条),
 
所以電泳时间可缩短到 0.5~1 小时。
 
4、染色-紙上電泳在染色前要先将濾紙条加热烘干,而醋酸纤維素薄膜则可直接进行
 
染色,不必事先烘幹。染色劑的種類很多,要根據實驗材料及實驗目的來選擇。例如對于蛋
 
白质,常用的染色剂溴酚蓝、氨基黑 10B(Amido black 10B)、考马斯亮蓝(Coomassie brilliant
 
Blue)和丙春红 S(PonceaueS)等,后几种的灵敏度较高,是醋酸纤維素薄膜電泳常用的
 
顯色劑。染色後通常要用適當漂洗液(例如 5%醋酸)漂洗,經幾次換漂洗液直到背景漂洗
 
清楚爲止。
 
5、定量-染色後,用剪刀將各蛋白色帶剪開,另在空白部分剪下一條(寬度相當于幾
 
个色带的平均宽度)作为空白对照,分别将各条放入有 4ml 1.5%NaOH 液的试管中,轻轻振
 
動到各管中色條的顔色溶入溶液後,以空白對照管作爲空白進行比色,即可根據各管光密度
 
值推算出各部分蛋白質的含量百分比。
 
对于醋酸纤維素薄膜電泳,还可以将干的薄膜条浸入新鲜配制透明液(3:7 比例混合
 
的冰醋酸-无水乙醇溶液),经 10~20 分钟,贴在玻璃板上,干后即成透明薄膜,可直接用
 
光密計讀出各個色帶的顔色深淺,進一步推算各種蛋白質的含量百分比。
 
對于脂蛋白、糖蛋白或核酸等,則可另選用適當的染色方法並進行定量。

 
(三)琼脂及琼脂糖凝胶電泳
 
瓊脂糖是瓊脂的主要成分,它的水溶液和瓊脂一樣可以制成凝膠,具有多孔網狀結構,
 
但它已除去含硫酸根的果胶成分,所以不象琼脂那样产生相当明显的電渗现象,電泳的效果
 
更佳。
 
琼脂或琼脂糖凝胶電泳的基本原理和紙上電泳相同,只不过是固相支持物的材料不同。
 
这类電泳因凝胶含水量大(98~99%),近似自由電泳,受固相支持物的影响较小,電泳速度
 
快而且區帶整齊,分辯率高,所以應用得也很爲廣泛。
 
这类凝胶電泳的基本过程和紙上電泳也很相似,只不过是要先配成 1~2%溶液浇在玻璃
 
板上制成凝胶板(琼脂糖的溶液浓度要低一些,0.5%左右即可制得满意的凝胶板)。電泳所
 
需的電流较大,可达到 2 毫安/厘米(宽)甚至更高些,而電泳时间可以缩短,通常常在 1
 
小时左右即可以达到良好的分离。琼脂或琼脂糖凝胶電泳完毕后,凝胶板要先烘干再进行染
 
色,爲了避免在烘幹過程中,各蛋白質區帶可能因擴散而變得模糊,要用酒精醋酸固定液處
 
理再进行烘干。至于染色、漂洗与定量等操作,基本上与紙上電泳或醋酸纤維素薄膜電泳相
 
似,這裏不再作詳細介紹。
 
琼脂凝胶電泳和琼脂糖凝胶電泳的主要区别之一,就是琼脂凝胶有相当大的電渗作用。
 
所谓電渗作用(electro-osmosis),如前所述,是指在電场影响下緩沖溶液緩慢地向一極移动
 
的现象,这种现象的发生,就是由于琼脂的表面带有大量负電荷(酸根),而周围緩沖液中
 
带正電荷的阳离子则受電场的影响而向负極移动,这种緩沖液的流动方向正好和蛋白质泳动
 
的方向相反,使蛋白質的顆粒泳動過程有如“逆水行舟”,表現出來的泳動速度減慢,特別是
 
对于泳动速度本来就是慢的蛋白质颗粒(如 γ-球蛋白),甚至会被緩沖液沖到起点的后面
 
去,好象这些蛋白质向阴極泳动那样,而与其它颗粒向阳極移动的表现不同。这种電渗现象
 
无疑要影响電泳的效果,降低分辩率,所以应用電渗作用弱的琼脂糖凝胶作支持物,電泳效
 
果就會比瓊脂凝膠好。
 
 
 
带正電的液层向负極移动

\
 
(四)聚丙烯酰胺凝胶電泳
 
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺和 N,N'-甲叉雙丙烯酰胺的高分子聚合物。
 
单体丙烯酰胺(acrylamide 简称 Acr)及其交联剂 N,N'-甲叉双丙烯酰胺(N,N'-
 
methylene-bis-acrylamide,簡稱 Bis)的結構式是:
 
O
 
 
Acr:CH2=CH—C—NH2
 
O O
 
Bis : CH2=CH — C — NH — CH2 — NH — C — CH=CH2
 
 
它們的聚合物有多孔的網狀結構,其網孔的大小可因單體及交聯劑的濃度、比例以及聚
 
合的条件的不同而不同,这些网孔对電泳时大分子物质的穿行产生一定阻力,其阻力大小与
 
大分子的大小、形状有关,所以它具有一定“分子筛”的作用,从而使以它作支持物的電泳的
 
分辨率得到提高。
 
 

  CH2   CH2  
      NH NH  
           
    C=O     C=O  
     
 
 
——CH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH——
 

  C=O         C=O         C=O  
               
  NH2     NH     NH2  
         
      CH2            
        NH            
                 
            C=O            
                 
                     
                           
 
 
——CH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH——
 

      C=O     C=O     C=O       C=O  
             
        NH       NH2 NH2       NH  
               
  CH2                   CH2  
      NH                       NH  
                       
        C=O                         C=O  
                       
                             
                                             
 
 
——CH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH-(CH2-CH-)nCH2-CH——
 

    C=O     C=O     C=O  
         
NH2     NH       NH2  
         
          CH2            
                   
 

 
聚丙烯酰胺凝膠和澱粉凝膠一樣都有分子篩的作用,但聚丙烯酰胺凝膠的機械強度及化
 
學穩定性好,可以人工控制網孔的大小以適應不同分離目的的要求。
 
聚丙烯酰胺凝胶電泳常用的方法是将凝胶装在玻璃管中垂直进行電泳,称为柱状電泳,
 
但也可以铺成凝胶板,平卧或垂直进行電泳,称为板状電泳。
 
聚丙烯酰胺凝胶電泳可以和一般電泳那样采取緩沖液组成、pH 及孔径大小都均匀的介
 
质这样的電泳方式称为“连续系统”(continuous system)的電泳,例如紙上電泳,醋酸纤維
 
素薄膜電泳及琼脂凝胶電泳等都属于这类。但聚丙烯酰胺凝胶電泳还可以采用緩沖液组成、
 
pH 和孔径都不均一的凝胶,这样的電泳方式称为“不连续系统”(dicontinuous system)的電
 
泳。它具有非常高的分辨率,在柱状電泳时每种蛋白质组分的色带非常狭窄,呈圆盘(disc)
 
状,所以这类不连续系统柱状電泳亦称为盘状電泳(disc-electro-phoresis),因为 disc 正
 
好就是英文“不连续”这词的字头。目前,常用的聚丙烯酰胺凝胶電泳(PAG 電泳)主要就是
 
采用这种盘状電泳的技術。
 
盘状電泳所用的凝胶包括:(1)可利用凝胶分子筛效应及颗粒带有不同数量電荷的效应
 
而达到分离目的凝胶层,称为分离胶(Separation gel)。这分离胶除了象普通電泳那样要有
 
适合緩沖液 pH 值(通常为 pH 8~9),而且它的网孔较小以便发挥其分子筛效应来提高分辨
 
率,所以这层凝胶层亦称为小孔胶(Smallpore gel)。(2)在分离胶前还要有可将样品中蛋
 
白质压缩浓集成一扁层的凝胶层,称为浓缩胶(Stacking gel)。这层凝胶的网孔很大,分子
 
筛效应極微,所以这层胶是大孔胶(Large-pore gel)。浓缩胶可以将样品压缩成扁的窄带,
 
是盤狀泳具有很高分辨率的重要原因,這種濃縮效應和凝膠的組成有密切關系。
 
浓缩胶除了网孔径与分离胶不同外,它的緩沖液组成及pH值也和分离胶不同,即緩沖
 
液组成、pH和网孔孔径在这层凝胶中都是不连续的。浓缩胶的緩沖液pH值是偏酸的(pH
 
6.7),而且含有HCl和甘氨酸,HCl几乎完全電离成Cl,而甘氨酸因接近等電点而極少電离,
 
这样在電场作用下,Cl的泳動最快(先行離子),甘氨酸泳動最慢(隨後離子),而樣品中
 
的蛋白質的泳動速度介于這兩種離子之間。當Cl快速泳動時,在它的後面形成一個離子濃
 
度低的低電导区,增大電位梯度,从而加速了蛋白质离子与甘氨酸离子的移动速度。就是这
 
樣,蛋白質離子就被這兩種離子夾在中間迅速向前移動,濃縮成爲一個薄層,直到遇到網孔
 
小的分離膠爲止。通過這種濃縮效應,可以使蛋白質濃縮好幾百倍,集中到厚度僅爲 10~100
 
微米的扁平区带中。在这区带中,由于各种蛋白质所带電荷不同,泳动速度不同,所以也是
 
按一定順序排列起來的。
 
当電泳过程继续进行,到达小孔分离胶界面后,蛋白质的泳动速度减慢,但甘氨酸的分

 
子量小就可以越过蛋白质而向前移动,而且由于分离胶的 pH 值偏碱,甘氨酸的電离能力增
 
大,泳动速度大大超过蛋白质。所以在分离胶中上述浓缩效应即告消失,而是由電荷效应和
 
分子筛效应进一步将各种蛋白质组芳堷行分离,完成電泳的分离过程。
 
盘状電泳的具体操作过程包括如下几个基本步骤:
 
1、仪器的准备-盘状電泳所用的電泳槽分为上下两槽,分别在中央装有铂丝電極,上
 
槽底部开有若干安装凝胶的小孔。凝胶管一般采用内径 5~7 毫米,长为 8~10 厘米的管径均
 
勻的玻璃管,兩端用金鋼砂磨平。
 
2、凝胶管的制备-首先将玻璃管下口用玻璃紙或其它材料封住,垂直固定在架上。然
 
後按選擇好的配方制備凝膠。制備凝膠除需要一定濃度的單體和交聯劑外,還需要加入少量
 
催化劑與加速劑。常用催化劑有兩種:(1)過硫酸铵,它能氧化單體生成遊離基而促進聚合,
 
這催化反應要在堿性及無氧條件下才易進行,所以要先將溶液減壓除氣再混合制膠;(2)核
 
黃素,它在光線照射下可産生遊離基,促進聚合反應的進行。常用的加速劑是 N,N,N',
 
N'四甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetramethyl ethylene diamine,简写为 TEMED),也可以用
 
β-二甲基丙腈(β-dimethylamino-propionitile,簡稱 DMPN)或三乙醇胺代替。制備凝膠
 
柱時,首先將制分離膠的溶液除氣混合好,迅速用滴管小心移入前面准備好的凝膠柱玻璃管
 
内,再复以约 0.5 厘米的蒸馏水层(隔绝空气并使胶面平整),静置半~小时使聚合成凝胶。
 
将蒸馏水吸弃后,再按同样方法再在分离胶上注入浓缩胶液(约 1 厘米高的液柱,根据加样
 
的容量大小而适当增减注入量),上面再复以蒸馏水层。染忬 在日光灯下照射(浓缩胶通
 
常用核黃素作催化劑)使凝膠聚合,凝膠柱即告制成,可用橡皮墊(或橡皮塞)將柱安裝在
 
上层電泳槽的底部小孔上,并使柱顶刚露出橡皮垫上。染忬将凝胶柱插入盛有緩沖液的下電
 
泳槽內。
 
3、加样-为了避免被緩沖液沖散,样品通常要用浓缩胶液(以样品液代替其中的蔗糖
 
液)混合,按制备浓缩胶方式在浓缩胶层上面再铺制样品胶。也可以用分离胶的緩沖液和蔗
 
糖将样品适当稀释和制成浓蔗糖液,这样加到浓缩胶面上也可以有效地防止样品的沖散。通
 
常每根凝胶柱加样量为 10~100 微克蛋白质,而且要求加样液的离子强度要低,最好要和浓
 
缩胶有相同的緩沖组成,pH 和离子强度,否则不能很好地发挥其浓缩效应,使分离的区带
 
模糊和松散,得不到良好的分離效果。
 
4、通電-加样后将電極槽緩沖液小心放在样品层上(也可以放緩沖液,染忬用长注射
 
器针小心将样品蔗糖注入緩沖液下面的凝胶面上),并在上電泳槽中倾入适量電極槽緩沖液,
 
使液体足以和蓋上的铂丝電極接触。为了便于观察,还要向上槽緩沖液中加入少量溴酚蓝作

 
示踪指示剂。染忬将電極接上電源,上槽接负極,下槽接正極。开始保持電流为每管约 1 毫安,待示踪染料进入浓缩胶并开始进入分离胶后,将電流增大到每管 2~3 毫安。待示踪染料将近到达凝胶管下口时,停止通電,切断電源。
 
5、剥胶-取下凝胶管,用带有长注射针头的注射器盛蒸馏水,将针头插入凝胶与管壁的间隙,边旋转玻璃管边慢慢沿管壁注入蒸馏水,使胶与管壁脱离,染忬用压缩空气将凝胶条吹出。
 
6、固定和染色-取出的凝胶条迅速放入三氯醋酸溶液固定,染忬再用适合的染色液染色,最后再用稀醋酸漂洗或进行電解脱色。也可以不经固定直接放入用三氯醋酸配置的染色液中进行染色如用考马斯蓝的三氯醋酸溶液染色,还可以经漂洗而得到清晰的染色带。最后凝胶条可放入稀醋酸浸泡保存。
 
盘状電泳不但分辩率高,而且灵敏度高,只要有蛋白质 1 微克甚至更少些即足以得到清晰可辨的一个染色带,因此它已成为目前生物大分子研究的重要方法之一。
 
聚丙烯酰胺凝胶電泳应用的另一种常见形式是直板型電泳,祥见下篇。
 
此外,聚丙烯酰胺凝胶電泳由于其机械强度高和化学稳定性好,它还可以添加其它化合物而
 
扩大電泳技术的应用范围。例如,添加去污剂十二烷基硫酸钠(简称 SDS),蛋白质因为和
 
SDS 结合而带有大量電荷而消除蛋白质原有的電荷量差别,其泳动速度便主要和分子大小
 
有关,这种 SDS-聚丙烯酰胺電泳广泛应用来测定蛋白质的分子量。又如,添加人工合成
 
的两性電解质混合物,通電后就可使这些两性電解质按等電点的不同而形成一个 pH 梯度,
 
使各种蛋白质因等電点不同而分别聚集在其相应的 pH 区带中,即可以用于蛋白质的分离,
 
也可用作蛋白质等電点的测定,这种技术就称为凝胶等電聚集電泳(Gelisoelectric focusing
 
electrophoresis)。

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